科學(xué)家成功構建胚胎干細胞嵌合體猴
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11月9日，《細胞》（Cell）雜志以封面文章形式在線(xiàn)發(fā)表了題為《高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴》（Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells）的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心、上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心劉真研究組、腦智卓越中心非人靈長(cháng)類(lèi)研究平臺孫強研究團隊和中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究組合作完成，在國際上首次成功構建了高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴，并證實(shí)了猴胚胎干細胞可以高效地貢獻到胚外胎盤(pán)組織和生殖細胞。這對于理解靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構建奠定了技術(shù)基礎。
胚胎干細胞是指由著(zhù)床前囊胚的內細胞團在體外分離培養而來(lái)的多能性細胞，在模式動(dòng)物構建、細胞治療、器官再生、類(lèi)器官模型等生物醫藥領(lǐng)域發(fā)揮著(zhù)重要作用。胚胎干細胞具有體外無(wú)限自我復制更新、誘導實(shí)現多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關(guān)鍵特征，其中胚胎注射形成嵌合體被公認為是評估胚胎干細胞多向分化潛能的“金標準”。
小鼠胚胎干細胞注射到囊胚并形成嵌合體的技術(shù)是構建遺傳修飾小鼠模型的關(guān)鍵技術(shù)。1984年首次實(shí)現小鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體，2008年成功實(shí)現大鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體。建立非人靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞嵌合體技術(shù)對于生物醫藥研究具有非常重要的意義，然而非人靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞嵌合體研究一直進(jìn)展緩慢。
該研究的首要問(wèn)題在于獲得具有高效發(fā)育潛能的胚胎干細胞。針對這一問(wèn)題，研究團隊建立了處于6種不同培養體系下的食蟹猴胚胎干細胞，進(jìn)而從克隆形態(tài)、免疫熒光、單細胞轉錄組、線(xiàn)粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等多方面，對處于不同培養條件下的食蟹猴胚胎干細胞進(jìn)行全面系統評估。研究發(fā)現，5iLAF、4CL和PXGL體系下培養的食蟹猴胚胎干細胞具有較高的多能性，而且4CL體系下的干細胞具有更好的傳代穩定性和基因組穩定性。
胚胎干細胞注射入受體胚胎后的快速凋亡是影響胚胎干細胞成功嵌合的關(guān)鍵。研究團隊選用綠色熒光蛋白標記的4CL條件下的胚胎干細胞進(jìn)行猴胚胎注射實(shí)驗，通過(guò)測試干細胞注射入胚胎后的不同培養基和培養時(shí)間的組合，最終得到了既不影響胚胎正常發(fā)育又能保證干細胞存活的最優(yōu)嵌合胚胎培養條件。5iLAF和Primed體系下的胚胎干細胞在該優(yōu)化條件下也表現出胚胎注射后的高存活率。研究人員將注射了4CL和5iLAF干細胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養到第17天，發(fā)現注射的胚胎干細胞仍然可以高效存活，單細胞測序表明猴胚胎干細胞可以與受體胚胎細胞同步發(fā)育，并且貢獻到第17天猴胚胎的不同細胞譜系中。
在系統性評估了不同培養條件下猴胚胎干細胞狀態(tài)和改進(jìn)優(yōu)化了嵌合胚胎培養條件的基礎上，研究團隊進(jìn)一步將注射了綠色熒光標記的4CL干細胞的胚胎移植到代孕母猴。在總共得到的10只出生或流產(chǎn)的仔猴中，有一只出生存活猴和一只流產(chǎn)猴檢測到胚胎干細胞的嵌合。研究團隊建立了包含PCR擴增、微衛星親子鑒定、基因組單核苷酸多態(tài)性深度測序、流式細胞儀檢測、綠色熒光蛋白檢測、免疫熒光檢測的一系列嚴格的嵌合體分析流程，發(fā)現出生存活猴中胚胎干細胞的貢獻比例高達70%左右，流產(chǎn)猴中胚胎干細胞的貢獻比例約20%。單細胞轉錄組測序也進(jìn)一步表明了注射的胚胎干細胞可以跟受體胚胎細胞同步分化到出生個(gè)體猴的各種不同細胞譜系中。
胎盤(pán)組織和生殖細胞是胚胎發(fā)育和重編程過(guò)程中的兩類(lèi)特殊組織或細胞。其中胎盤(pán)組織是由滋養外胚層發(fā)育而來(lái)，而生殖細胞發(fā)育過(guò)程中要經(jīng)歷更加劇烈的表觀(guān)重編程。研究團隊在兩只嵌合體猴的胎盤(pán)組織中均發(fā)現了胚胎干細胞的高比例貢獻。考慮到小鼠胚胎干細胞幾乎不會(huì )貢獻到胎盤(pán)組織，該結果說(shuō)明靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞可能具有不同于嚙齒類(lèi)的獨特發(fā)育全能性特征。此外，兩只嵌合體猴的生殖細胞中也發(fā)現了胚胎干細胞的高比例貢獻，這對后續基于該技術(shù)的遺傳修飾模型構建至關(guān)重要。
該工作建立了系統評估不同培養條件下猴胚胎干細胞多能性狀態(tài)的研究體系，并探索得到有利于胚胎干細胞存活的胚胎嵌合體培養條件，顯著(zhù)提升了胚胎干細胞注入胚胎后的存活效率，最終得到了出生存活的高比例胚胎干細胞貢獻的嵌合體猴，證實(shí)了注入的猴胚胎干細胞可以高效地貢獻到包括胎盤(pán)和生殖細胞在內的各種不同組織和細胞。該研究對于理解靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞全能性和發(fā)育潛能具有重要意義，為建立基于猴胚胎干細胞嵌合體的基因打靶和模型構建技術(shù)奠定了基礎。
該研究嚴格遵守生物倫理規范，所有實(shí)驗均符合國際干細胞研究學(xué)會(huì )的研究指南，并經(jīng)過(guò)腦智卓越中心倫理委員會(huì )審核。劉真、孫強和Miguel A. Esteban為該論文共同通訊作者。該研究獲得科技部、中國科學(xué)院、上海市、國家自然科學(xué)基金委的資助，得到多家科研機構和高校多位專(zhuān)家和合作人員的大力支持，以及腦智卓越中心光學(xué)成像平臺和分子細胞技術(shù)平臺的技術(shù)支撐。
不同培養條件下猴胚胎干細胞中SOX2、NANOG和KLF17的免疫熒光
不同細胞注射的嵌合胚胎體外延遲培養效果圖
非人靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞嵌合體研究模式圖
胚胎干細胞嵌合體猴卡通寓意圖被選為該期《細胞》雜志封面
